Carbohydrate-rich high-molecular-mass antigens are strongly recognized during experimental Histoplasma capsulatum infection / Antígenos de alta massa molecular ricos em carboidratos são fortemente reconhecidos durante infecção experimental por Histoplasma capsulatum

INTRODUCTION: During histoplasmosis, Histoplasma capsulatum soluble antigens (CFAg) can be naturally released by yeast cells. Because CFAg can be specifically targeted during infection, in the present study we investigated CFAg release in experimental murine histoplasmosis, and evaluated the host humoral immune response against high-molecular-mass antigens (hMMAg. >150 kDa), the more immunogenic CFAg fraction. METHODS: Mice were infected with 2.2x10(4) H. capsulatum IMT/HC128 yeast cells. The soluble CFAg, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, and IgG-hMMAg circulating immune complexes (CIC) levels were determined by enzymelinked immunosorbent assay, at days 0, 7, 14, and 28 post-infection. RESULTS: We observed a progressive increase in circulating levels of CFAg, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, and IgG-hMMAg CIC after H. capsulatum infection. The hMMAg showed a high percentage of carbohydrates and at least two main immunogenic components. CONCLUSIONS: We verified for the first time that hMMAg from H. capsulatum IMT/HC128 strain induce humoral immune response and lead to CIC formation during experimental histoplasmosis.

INTRODUÇÃO: Durante a histoplasmose, os antígenos solúveis de Histoplasma capsulatum (CFAg) podem ser liberados naturalmente pelas células leveduriformes. Considerando que os CFAg constituem um alvo específico durante a infecção, no presente estudo nós investigamos a liberação de CFAg durante a histoplasmose murina experimental, e avaliamos a resposta imune humoral do hospedeiro contra antígenos de alta MM (hMMAg; >150 kDa), altamente imunogênicos. MÉTODOS: Camundongos foram infectados com 2.2x10(4) leveduras de H. capsulatum, cepa IMT/HC128. Os níveis de CFAg solúveis, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, e também de imunocomplexos circulantes (CIC) IgG-hMMAgs foram determinados por ELISA nos dias 0, 7, 14 e 28 após a infecção. RESULTADOS: Após a infecção por H. capsulatum, observamos um aumento progessivo de CFAg circulantes, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, e também de CIC IgG-hMMAgs. Os hMMAg apresentaram alta porcentagem de carboidratos e, pelo menos, dois componentes imunogênicos. CONCLUSÕES: Mostramos pela primeira vez que os hMMAg de H. capsulatum cepa IMT/HC128 induzem resposta imune humoral e levam à formação de CIC durante a histoplasmose experimental.

High molecular mass fraction in clinical isolates of Paracoccidioides brasiliensis / Fração de alta massa molecular em isolados clínicos de Paracoccidioides brasiliensis

INTRODUCTION: Different serum levels of the IgG/IgE for Paracoccidioides brasiliensis high mass molecular (hMM) fraction (~366kDa) in the acute and chronic forms of the disease have been reported. Considering the nonexistence of hMM fraction investigation involving clinical isolates of P. brasiliensis, the present study aimed to investigate the presence of the hMM fraction (~366kDa) in cell free antigens (CFA) from P. brasiliensis clinical isolates. METHODS: CFA from 10 clinical isolates and a reference strain (Pb18) were submitted to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by gel image capturing and densitometer analysis. Additionally, CFA from 20 isolates and Pb18 were analyzed by capture ELISA (cELISA) using polyclonal (polAb) or monoclonal (mAb) antibodies to the hMM fraction. RESULTS: The presence of the hMM component was observed in CFA of all samples analyzed by SDS-PAGE/densitometry and by cELISA. In addition, Pearson's correlation test demonstrated stronger coefficients between hMM fraction levels using pAb and mAb (R = 0.853) in cELISA. CONCLUSIONS: The soluble hMM fraction was present in all the P. brasiliensis clinical isolates analyzed and the reference strain Pb18, which could be used as a source of this antigen. The work also introduces for first time, the cELISA method for P. brasiliensis hMM fraction detection. Analysis also suggests that detection is viable using polAb or mAb and this methodology may be useful for future investigation of the soluble hMM fraction (~366kDa) in sera from PCM patients.

INTRODUÇÃO: Diferentes níveis sorológicos de IgG/IgE contra a fração de alta massa molecular (hMM) (~366kDa) de Paracoccidioides brasiliensis têm sido encontrados na PCM aguda e crônica. Considerando a inexistência de investigação sobre esta fração em isolados clínicos de P. brasiliensis, o objetivo deste estudo foi investigar a presença da fração hMM (~366kDa) no preparado livre de células (CFA) de P. brasiliensis obtidos de isolados clínicos. MÉTODOS: CFA de 10 isolados e de cepa de referência (Pb18) foram submetidas à eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de captura de imagem e análise por densitometria. Adicionalmente, CFA de 20 isolados e de Pb18 foram analisados por ELISA captura (cELISA) utilizando anticorpos policlonal (polAb) ou monoclonal (mAb) para fração hMM. RESULTADOS: A presença do componente de hMM foi observada em todas as amostras analisadas por SDS-PAGE/densitometria e por cELISA. Adicionalmente, o teste de correlação de Pearson demonstrou forte relação entre os níveis de fração hMM usando pAb e mAb (R = 0.853) no cELISA. CONCLUSÕES: Conclui-se que a fração hMM está presente em todos os isolados clínicos de P. brasiliensis analisados e no isolado referencial, sugerindo a possibilidade dos mesmos serem utilizados como fonte desta fração antigênica. Este trabalho também introduz pela primeira vez o método de cELISA para detecção da fração hMM de P. brasiliensis, sugerindo que detecção utilizando anticorpos polAb ou mAb é viável e essa metodologia poderá ser útil para investigação futura desta fração solúvel (~366kDa) em soros de pacientes com PCM.

Resposta imune humoral na paracoccidioidomicose experimental em camundongos ddY / Humoral immune response in experimental ddY mice paracoccidioidomycosis

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, restrita à América Latina, com maior incidência noBrasil. O camundongo ddY tem sido empregado como modelo murino de PCM e, no entanto, não há informaçõesa respeito da resposta imune desse animal frente à infecção. O presente estudo tem como objetivo avaliar aresposta imune humoral específica para o principal antígeno, gp43, do fungo Paracoccidioides brasiliensis,em camundongos ddY infectados com a cepa virulenta Pb 18. Foram realizadas análises da antigenemia ehistopatológico em vários órgãos e em diferentes tempos pós-infecção. Os resultados obtidos demonstraramaumento nos níveis de IgG anti-gp43 nos dias 14, 17, 21, 24, 28 e 56 pós-infecção e aumento no nível de gp43solúvel aos 28 dias pós-infecção. As células fúngicas foram detectadas em todos os órgãos analisados(cérebro, coração, pulmão, fígado, baço e rim) e em todos os períodos. As lesões granulomatosas tornaramsepredominantes 14 dias pós-infecção. Os resultados evidenciaram que o camundongo ddY produz respostaimune humoral frente ao principal antígeno de P. brasiliensis, apresentando-se elevado até 56 dias pósinfecção.A redução do nível de gp43 solúvel na fase crônica, supostamente devido ao início do controle dainfecção, requer estudos complementares adicionais.

Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis, restrict to Latin America, with higher incidence inBrazil. ddY mice have been used as experimental PCM model, although there is no data regarding immuneresponse. The aim of the present study was evaluated specific humoral response against the main specificantigen of the fungal Paracoccidioides brasiliensis, the gp43, in ddY mice infected with virulent Pb 18.Antigenemia analysis and histophatological exam in several organs were performed in different time post-infection The results showed increased levels of anti-gp43 IgG on days 14, 17, 21, 24, 28 and 56 post-infectionand increased levels of soluble gp-43 on day 28 post-infection. The fungal cells were detected in all organsanalyzed (brain, heart, lung, liver, spleen and kidney) in all investigated periods. The granulomatous lesionsbecame predominant 14 days after infection. The results evidence that ddY mice produce humoral immuneresponse to main P. brasiliensis antigen, with high levels until 56 days after infection. Further studies areneeded to show that reduction of soluble gp43 in chronic phase correlates with infection control.

Candida dubliniensis in a Brazilian family with an HIV 1- infected child: identification, antifungal susceptibility, drug accumulation and sterol composition

This study investigated the prevalence of C. dubliniensis in a Brazilian family with an HIV - infected child. A total of 42 oral isolates were obtained from eight family members. The identification of C. dubliniensis was performed by polymerase chain reactions (PCR) using primers against a specific sequence of the C. dubliniensis cytochrome b gene. Only the HIV-infected child and his grandmother were colonized by C. dubliniensis. In this study C. dubliniensis isolated from the HIV-infected child exhibited high susceptibility for azoles tested with MICs of 0.125 and 0.5 æg/mL for voriconazole and fluconazole, respectively. Accumulation of [³H] fluconazole in C. dubliniensis isolated from the HIV-infected child was slightly reduced in comparison to the reference susceptible strain. C. dubliniensis isolates had significantly lower ergosterol levels in comparison to C. albicans reference strains.

O presente estudo investigou a prevalência de C. dubliniensis em uma família brasileira com uma criança infectada pelo vírus HIV. Um total de 42 isolados orais foram obtidos de 8 membros da família. A identificação de C. dubliniensis foi realizada por polymerase chain reactions (PCR) usando primers contra a sequência específica para o gene C. dubliniensis cytochrome b. Apenas a criança infectada pelo vírus HIV e a avó estavam colonizados por C. dubliniensis. Neste estudo C. dubliniensis isolado da criança infectada pelo vírus HIV exibiu alta susceptibilidade para azoles com concentração mínima inibitória de 0.125 and 0.5 æg/mL para voriconazole and fluconazole respectivamente. Acúmulo de [³H] fluconazol intra-celular foi ligeiramente reduzido em C. dubliniensis isolado da criança infectada pelo vírus HIV em comparação com a cepa referência sensível ao fluconazole. Isolados de C. dubliniensis neste estudo apresentaram níveis significantemente reduzidos de ergosterol da membrane celular em comparação com C. albicans.

Isolation of Paracoccidoides brasiliensis from armadillos (Dasypus novemcinctus) captured in an endemic area of paracoccidioidomycosis

Paracoccidioides brasiliensis, the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), was first isolated from the Amazonian gerion where the mycosis is uncommon. In the present study, we report on the high incidence of PCM infection in armadillos from a hyperendemic region of the disease. Four nine-banded armadillos (Dasypus novemcinctus) were captured in the endemic area of Botucatu, Sao Paulo, Brazil, killed by manual cervical dislocation and autopsied under sterile conditions. Fragments of lung, spleen, liver and mesenteric lymph nodes were precessed for histology, cultured on Mycosel agar at 37ºC, and homogenized for inoculation into the testis and peritoneum of hamster. The animals were killed from week 6 to week 20 postinoculation and fragments of liver, lung, spleen, testis, and lymph nodes were cultured on brain heart infusion agar at 37ºC. Paracoccidioides brasiliensis was isolated from three armadillos both by direct organ culture and from the liver, spleen, lung, and mesenteric lymph node hamster. In addition, one positive armadillo presented histologically proven PCM disease in a mesenteric lymph node. The three aramdillos isolates (Pb-A1, Pb-A2, and Pb-A4) presented thermodependent dimorphism, urease activity, and casein assimilation, showed amplification of the gp43 gene, and were highly virulent in intratesticulary inoculation hamster. The isolates expressed the gp43 glycoprotein, the immunodominant antigen of the fungus, and reacted with a pool of sera from PCM patients. Taken together, the present data confirm that armadillos are a natural reservoir of P. brasiliensis and demonstrate that the animal is a sylvan host to the fungus

Chlamydospore formation by Paracoccidioides brasiliensis mycelial form

O papel do conteúdo nutritivo do meio de cultura e de oxigênio na produçäo de clamidósporos pela fase micelial do Pracoccidioides brasiliensis foi investigado. Quatro cepas do fungo (18, Bt4, 1183, Pb9) foram cultivadas, a 25-C, em meio sólido rico e pobre em nutrientes. As cepas 18 e 1183 foram também cultivadas em anerobiose em atmosfera de nitrogênio. A cepa 18 produziu grande número de clamidósporos terminais e intercalares após 7-10 dias de cultura em meio sólido pobre em nutrientes (agar 2%, com dextrose e polipeptona 0,1%). As outras três cepas produziram número significativamente menor de esporos. A cepa 18 näo produziu clamidósporos quando cultivada em dois meios ricos em nutrientes (infusäo de cérebro e coraçäo, e agar destrose de batata). A incubaçäo anaeróbica da cepa 18 em atmosfera de nitrogênio apresentou pequeno crescimento micelial com a presença de numerosos clamidósporos. A nivel ultraestrutural, os clamidósporos apresentam um ou mais núcleos e numerosas mitocôndrias, indicativos de potencial para posterior desenvolvimento. Assim, os esporos produziram gemulaçäo múltipla 1 dia após incubaçäo a 35-C. Os resultados demonstraram que, sob condiçöes ambientais adversas, a fase micelial do P. brasiliensis produz clamidósporos em curto período de tempo. É possível que o fungo encontre condiçöes semelhantes no solo, produzindo os esporos, que poderiam desempenhar papel na propagaçäo da paracoccidioidomicose